必一体育:天津中医药大等:网药整合体内实验探究脉络舒通丸抗血
栏目: 业界资讯 发布时间 2024-12-23 11:06:30 来源:必一B体育下载 作者:必一体育app官方

  血栓性浅静脉炎( superficial thrombophlebitis , STP )是临床常见的一种血栓性、炎症病变的血管性疾病,主要表现为病变浅静脉出现条索状硬块,形如蚯蚓,色赤,可出现局部红肿疼痛 [1] 。由于其早期临床症状相对较轻,患者未进行及时有效的治疗,出现血栓脱落,可诱发深静脉血栓、心、肺、脑血管栓塞等并发症,对生命健康造成严重威胁。临床上常用的治疗药物多为抗感染、抗凝、溶栓类药物、非甾体抗炎药、免疫等,虽然能在一定程度上缓解患者的临床症状,但其治愈率低,治疗效果欠佳,治疗成本较高且常导致多种不良反应 [2] 。中医认为 STP 属于“赤脉、青蛇毒、恶脉、脉痹”等范畴,湿热浊瘀阻络是基本病机,应采用清热利湿、化瘀通络、祛湿消肿的方式治疗。

  脉络舒通丸源于国医大师唐祖宣先生的经验方,全方由黄芪、金银花、黄柏、苍术、薏苡仁、玄参、当归、白芍、水蛭、蜈蚣、全蝎和甘草共 12 味中药组成,方中黄芪、金银花为君药;黄柏、苍术、薏苡仁、当归、白芍、玄参为臣药;水蛭、全蝎、蜈蚣为佐药;甘草为使药,调和诸药;共奏清热解毒、化瘀通络、祛湿消肿的功效,与STP 湿热浊瘀阻络的病机相契合。现代药理学研究显示,黄芪和当归及其活性成分均具有抗氧化、抑制炎症介质表达、抗血小板凝集和抗血栓形成的作用[3-4] ;金银花和玄参的提取物可显著降低白细胞介素-1β (interleukin-1β ,IL-1β )、IL-6 和肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α ,TNF-α )的产生,达到良好的抗炎作用[5-6] ;水蛭、蜈蚣和全蝎均可抑制血小板聚集,增强纤溶活性,具有明显的抗血栓形成的功效[7] ,表明脉络舒通丸可起到防止血栓形成和抑制炎症作用。目前,脉络舒通丸广泛应用于临床治疗STP[8] ,疗效显著,不良反应少,但关于脉络舒通丸的研究主要集中在临床疗效方面,缺乏其具体作用机制方面的研究。

  网络药理学是在系统生物学的基础上结合现代的计算机技术构建“药物 - 靶点- 疾病”相互作用网络,揭示药物与治疗疾病之间的分子关联规律,从度探讨中医药与疾病的关系,体现中医药治疗疾病的整体性[9-11] 。因此,本研究首先基于网络药理学探讨脉络舒通丸抗STP 的潜在作用机制,筛选出关键信号通路,然后通过体内动物实验,采用20% 甘露醇建立STP 兔模型,运用Western blotting 技术进一步探究脉络舒通丸抗STP 的作用机制,为其临床治疗STP 奠定坚实的理论基础和科学依据。

  36 只健康日本大耳白兔,雌雄各半,2.50 ~2.75 kg , 购自中国食品药品检定研究院[许可证号SCXK (京)2019-0006 ],饲养于天津中医药大学实验动物中心,适应性饲养7 d 。饲养条件为12 h 光照/12 h 黑暗,单笼饲养,室温(25 ±2 )℃,自由饮水和进食。本实验中所有操作均符合相关动物实验伦理原则,并获得天津中医药大学实验动物伦理委员会批准(批准号TCM-LAEC2021253 )。

  Infinite M200 Pro 型多功能酶标仪(瑞士Tecan 公司);3K15 型冷冻高速离心机(美国Sigma 公司);ASP200S 型自动线H 型自动生物组织包埋机、RM2255 型切片机(德国Leica 公司);DYY-7C 型、DYCZ-40D 型电泳转膜设备(北京六一生物科技有限公司);Chemi Scope6200 型化学发光成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司);Nikon Ci-L 型显微镜(日本Nikon 公司)。

  2.1.1 脉络舒通丸活性成分及其作用靶点获取 运用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP ,)检索脉络舒通丸活性成分,并根据药物的吸收、分布、代谢、排泄(absorption, distribution, metabolism, excretion ,ADME )参数,设定口服生物利用度(oral bioavailability ,OB )≥30% 、类药性(drug-likeness ,DL )≥0.18 作为筛选条件,得到脉络舒通丸的潜在活性成分。由于TCMSP 中未筛选到水蛭、蜈蚣、全蝎的活性成分,故通过CNKI 数据库中相关文献补充水蛭、蜈蚣、全蝎的活性成分[12-17] , 将补充成分整合到TCMSP 数据库的筛选结果中。并应用PubChem 数据库()获取活性成分的简化分子线性输入规范(simplified molecular input line entry system ,SMILES )。

  2.1.3 蛋白质- 蛋白质相互作用(protein-protein interaction ,PPI )网络构建及分析 将脉络舒通丸的潜在活性成分作用靶点与STP 疾病作用靶点导入VENN ()在线工具,取其交集,获得共同靶点。通过STRING 数据库()对共同靶点进行PPI 网络构建。

  将 PPI 网络导入Cytoscape 3.7.2 平台进行可视化分析,并使用Network Analyzer 插件进行网络节点的拓扑参数分析。以“度值>中位数、介数中心性>中位数、中心接近度>中位数”作为筛选条件,获取脉络舒通丸抗STP 的核心靶点。

  2.2.1 分组、造模及给药 将36 只兔随机分为对照组、模型组、地奥司明(0.168 g/kg ,相当于临床等效剂量)组和脉络舒通丸低、中、高剂量(0.56 、1.68 、5.04 g/kg ,分别相当于临床剂量的1/3 、1 、3 倍)组 ,每组 6 只。除对照组外,其余各组采用双侧耳缘 iv 20% 甘露醇建立STP 兔模型,采用兔固定器限制兔子活动,距耳尖2 cm 处,用生理盐水进行耳缘静脉预穿刺,确保头皮针在静脉中同时药液无渗漏,以1 mL/min 缓慢推注20% 甘露醇溶液(4.0 mL/kg ),药物注射结束后推注1 mL 生理盐水,每日2 次注射,共注射14 d 。造模期间每日观察耳缘静脉及其周围组织皮肤颜色,若皮肤变红并有硬结,表示STP 兔模型构建成功。 造模同时,对照组和模型组ig 纯水,各给药组ig 相应药物,1 次/d ,连续14 d 。实验结束后,ip 戊巴比妥钠,静脉取血,离心获取血清;以静脉穿刺点前方1.5 cm 为中心,切取1 cm2 耳廓组织,用于后续实验。

  2.2.2 兔耳组织苏木素- 伊红(HE )染色 取兔耳组织经4% 多聚甲醛溶液固定,石蜡包埋后进行连续切片,进行常规HE 染色步骤,在光学显微镜下观察耳组织耳缘静脉及周围组织的病理学变化。

  2.2.3 血清炎症因子水平检测 取各组兔血清,按照ELISA 试剂盒说明书检测TNF-α 、IL-1β 和IL-6 水平。

  所有数据以 表示,采用SPSS 23.0 软件进行统计分析,多组间比较为正态分布时,采用单因素方差分析,方差齐使用LSD 法进行组间比较,方差不齐则用DunnettT3 检验;非正态分布用Kruskal-Wallis 秩和检验。

  3.1.1 脉络舒通丸活性成分及其作用靶点获取 根据TCMSP 数据库的检索结果及文献检索,收集整理并去除重复成分后得到脉络舒通丸145 个活性成分,其中黄芪活性成分14 个、金银花活性成分15 个、黄柏活性成分29 个、苍术活性成分2 个、薏苡仁活性成分8 个、玄参活性成分4 个、当归活性成分2 个、白芍活性成分6 个、甘草活性成分61 个、水蛭活性成分11 个、蜈蚣活性成分12 个、全蝎活性成分6 个。将各活性成分的SMILES 导入SwissTargetPrediction 数据库进行脉络舒通丸活性成分的作用靶点预测,共获取10 591 个成分作用靶点,去除9479 个重复靶点,得到脉络舒通丸的1112 个活性成分作用靶点。

  3.1.3 脉络舒通丸活性成分与STP 疾病的共同靶点PPI 网络构建及分析 将脉络舒通丸的1112 个活性成分作用靶点与837 个STP 疾病作用靶点导入Venn 在线工具,取其交集,并绘制Venn 图,得到共同靶点84 个,见图1 。将得到的84 个共同靶点导入STRING 数据库中,隐藏孤立靶点,构建得到具有80 个点,825 条边的共同靶点PPI 网络,见图2 ,

  其中节点代表共同靶点;节点大小和颜色深浅代表度值大小,节点越大、颜色越深,代表度值越大,靶点越关键;节点间连接的直线 个共同靶点之间有相互作用。

  将脉络舒通丸活性成分与STP 疾病的共同靶点PPI 网络导入Cytoscape 3.7.2 平台进行可视化分析,并使用NetworkAnalyzer 插件进行网络节点的拓扑参数分析。以度值>中位数(19.00 )、介数中心性>中位数(14.99 )、中心接近度>中位数(0.54 )作为筛选条件,得到31 个脉络舒通丸抗STP 的核心靶点,其关键拓扑参数,见表1 。

  3.1.4 脉络舒通丸抗STP 的关键靶点的GO 功能和KEGG 通路富集分析 使用DAVID 6.8 数据库对31 个脉络舒通丸抗STP 的核心作用靶点进行GO 功能富集分析(P <0.05 ),共得到150 个条目,包括113 个生物过程(biological processes ,BP )、22 种细胞组分(cellular components ,CC )、15 种分子功能 ( molecular functions , MF ),根据 P 值分别选取前 10 条进行可视化处理,见图 3 。 BP 主要涉及平滑肌细胞增殖的正调控、炎症反应的正调控、凋亡过程的调控等, CC 主要涉及细胞外区域、细胞外间隙、细胞膜等, MF 主要涉及 PI3K 结合、蛋白磷酸酶结合、内肽酶活性等,体现脉络舒通丸抗 STP 是多重作用的结果。

  KEGG 通路富集分析获得118 条相关信号通路(P <0.05 ),根据P 值由小到大顺序制作排名前20 的信号通路气泡图,见图4。